Формула рака

gordon0030@yandex.ru

Архив выпусков | Участники

↓№ 171↑

19.11.2002 Хронометраж

47:40

Что означает слово «рак» в медицине и обиходе? Чем отличается злокачественная опухоль от доброкачественной? Что такое «некроз клеток» и каковы внутренние, молекулярные механизмы рака? О бинемной модели хромосом и новых подходах к лечению злокачественных опухолей, — доктор биологических наук Андрей Лучник.

Смотрите также выпуск № 172 «Иммунотерапия рака».

Участник:

Лучник Андрей Николаевич — доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник Института биологии развития РАН

Предварительный план дискуссии:

• Что означает слово «рак» в медицине и обиходе? (Условимся на обиходном значении: все злокачественные опухоли.)

• Чем отличаются злокачественные опухоли от доброкачественных? (Хрупкостью хромосом, и, как следствие — некрозом клеток.)

• Что такое «некроз клеток»? (Один из двух типов гибели клеток а) запланированный — апоптоз и б) незапланированный — некроз (рак, заживление ран и т. д.))

• Почему у раковых клеток происходит некроз? (Неравномерное распределение кусков хромосом (ДНК) в митозе.)

• Что такое модель незаживающей раны в применении к злокачественной опухоли? (Универсальная модель для всех типов опухолей не зависящая от причин их возникновения.)

• Но каковы внутренние, молекулярные механизмы рака? Почему хромосомы раковых клеток хрупкие? (Бинемная модель хромосомы. Она же отвечает на вопрос о причинах кризиса в установлении полной нуклеотидной последовательности генома человека.)

• Как лечить рак в свете вашей модели? (Два пути: 1. Псевдомутагены; 2. Перевод клеток в апаптоз. Пробовали на добровольцах. Получилось. Однако предостережение от преждевременного оптимизма. Последствия химиотерапии, осложненная ситуация. Ограниченность природных ресурсов сырья. Предстоит большая работа по установлению структуры компонентов и их синтезу генно-инженерным или синтетическим путем. Требуются средства российского происхождения.)

• Назовите факторы риска как для здоровых, так и для больных раком.

• Нейрогуморальная система. Раковые клетки у каждого из нас.

Обзор темы:

Рак — одна из самых тяжелых и загадочных болезней. Существует множество причин, казалось бы, совершенно различных, которые могут стать «спусковым крючком» болезни, началом неконтролируемого деления злокачественных клеток. Но каковы внутренние, молекулярные механизмы рака? Возможно, все дело в структуре хромосом опухолевых клеток.

Главной причиной смерти человека в ХХ веке наряду с сердечно-сосудистыми заболеваниями стал рак. Отсюда и повышенное внимание к исследованиям причин рака и нахождению способов его лечения. Однако все надежды, что будет найдена некая противоопухолевая «панацея», рушились по мере того, как расширялись знания о природе рака. Более того, к концу ХХ века ученые окончательно пришли к выводу, что опухоль каждого вида имеет свои механизмы бесконтрольного роста. А значит, нельзя найти общий принцип лечения всех видов рака.

И все же универсальный механизм роста злокачественных опухолей существует. Этот механизм, или, вернее сказать, «адская машина», есть в каждой злокачественной опухоли, и устроен он на удивление просто. Его работа не зависит от конкретных причин возникновения опухолей. Причины бывают разными, однако все они, в конечном счете, вызывают определенные изменения структуры генома, то есть хромосом, содержащих наследственную информацию.

Превращение нормальной клетки в опухолевую происходит в два этапа: трансформация и малигнизация (злокачественность). На первом этапе клетки начинают бесконтрольно делиться, причем уже в лабораторных условиях — в колбе с питательным раствором. Однако такие клетки в большинстве случаев не вызывают злокачественного роста в живом организме. Механизмы трансформации изучены достаточно хорошо — главную роль здесь играют онкогены.

Второй этап — приобретение злокачественности — позволяет таким клеткам размножаться внутри организма. При этом клетки опухоли растут не сами по себе — организм животного или человека помогает им это делать. Активно подхлестывая рост опухоли, плоть больного совершает медленное самоубийство. Организм делает все возможное для того, чтобы опухоль росла. Он бережно пронизывает ее тысячами новых кровеносных сосудов и капилляров, он приобщает окружающие здоровые клетки, а также клетки крови и лимфы к обслуживанию опухоли, позволяя ей расти вширь. В этом процессе задействованы сотни биохимических реакций.

Отчего это происходит? Ответ на этот вопрос звучит до смешного просто: организм воспринимает растущую опухоль как незаживающую рану, которую следует залечить путем стимуляции роста ее клеток. Почему так? Если вы случайно порезали руку, немедленно начинается процесс заживления раны. Свертывание крови и агрегация клеток крови на поверхности раны — первый и исключительно важный этап заживления. Агрегирующие клетки крови (макрофаги, гранулоциты и тромбоциты) начинают выделять цитокины — белки, регулирующие деление клеток. Наиболее известные цитокины — факторы роста клеток. Говоря упрощенно, эти факторы вызывают рост новых клеток, заполняющих рану. Почему кровь сворачивается? Сигналом служат поврежденные или мертвые клетки на поверхности раны. (В пробирке кровь сворачивается от контакта с чужеродной стеклянной поверхностью.) Более того, тысячи клеток на поверхности раны, которые вы убили кухонным ножом, не молчат. Они вопиют о своей погибели — сами выделяют факторы роста и другие цитокины, стимулирующие рост и миграцию клеток. Цитокины кровяных клеток и мертвых клеток вызывают отек ткани: межклеточное пространство заполняется лимфой, и туда ползут лимфоциты и некоторые другие клетки, участвующие в ранозаживлении.

Таким образом, главным сигналом к делению клеток являются мертвые клетки на поверхности самой раны. Эти клетки не просто мертвые — они погибли путем некроза. Существует другой тип гибели клеток — апоптоз. Это когда организм в ходе нормальной жизнедеятельности уничтожает некоторые собственные клетки — образно говоря, производит очередную замену деталей в ходе «техосмотра». Подконтрольно гибнущие клетки не способны запустить каскад биохимических событий, заживляющих рану. Сделать это могут только некротически погибшие клетки. Так погибают клетки либо от физического повреждения, либо от случайных, не подвластных организму разломов хромосом. Некроз клеток происходит, например, при радиоактивном облучении (за исключением лимфоидных клеток). Радиация рвет молекулу ДНК в каких-то случайных местах. Разрывы ДНК (обеих нитей двойной спирали) активно залечиваются клеткой, однако 100% разрывов клетке удается залечить не всегда. Из незалеченных разрывов образуются разломы хромосом, видимые под микроскопом. Если клетка с разломанной хромосомой делится, две дочерние клетки с большой вероятностью умирают от некроза (вследствие нарушения баланса генетического материала у дочерних клеток). Такие клетки организм воспринимает как погибшие от случайного ранения, например от пореза руки кухонным ножом.

При заживлении раны деление клеток заканчивается, когда образуется рубец из полностью заполнивших рану новых клеток. Остановка деления клеток — завершающий этап заживления раны. Если рану порезать еще раз, опять начнется процесс деления клеток. Сигналом к нему послужат новые некротически погибшие клетки. В экспериментах с животными, у которых риск заболеть раком очень высок (высокораковые линии), стоит порезать одну и ту же рану несколько раз, чтобы вызвать злокачественный рост опухоли. У нормальных животных или человека этого бывает недостаточно.

Но если опухоль по тем или иным причинам уже возникла, ее клетки обязательно приобретают одно исключительно важное свойство — генетическую нестабильность, выражающуюся в том, что в каждом поколении клеток возникают случайные разломы хромосом с частотой примерно 1–30%. Потомство этих клеток, как мы уже знаем, нежизнеспособно: дочерние клетки гибнут от некроза. Если их, скажем, 10%, то этого вполне достаточно, чтобы система заживления ран набросилась на опухоль и стала стимулировать ее клетки к делению. Деление клеток опухоли автоматически приведет к появлению еще 10% мертвых клеток, а они опять подхлестнут систему заживления ран, и так до бесконечности, вернее, до физической смерти человека или животного. Заметим, что, жертвуя мертвыми клетками, опухоль растет медленнее, чем росли бы нормальные клетки, но взамен она получает возможность расти неограниченно — пусть медленно, но верно, и в конце концов она убьет организм.

Но почему в раковых клетках с высокой частотой возникают разломы хромосом, вызывающие некротическую гибель клеток?

Факт высокой частоты случайных хромосомных разломов в опухолевых клетках считается общепризнанным. Однако, если не понять причину высокой частоты случайных разломов хромосом в раковых клетках, нельзя целенаправленно бороться с опухолевым ростом. Причина этих разломов, по мнению А. Н. Лучника, кроется в неспособности раковой клетки ремонтировать двойные разрывы ДНК, которые и приводят к разломам хромосом. Нормальная клетка с высокой скоростью и эффективностью ремонтирует сотни разрывов ДНК, например после облучения.

Но что нужно для стимуляции такого процесса? А. Н. Лучник считает, что для ремонта разорванной молекулы ДНК требуется вторая копия, не имеющая разлома в том же самом месте. Молекулы «прижимаются» одна к другой, и генетическая информация с неповрежденной молекулы копируется в поврежденную, восстанавливая таким образом ее первоначальную структуру.

В здоровых клетках человека двойные разрывы ДНК залечиваются с огромной эффективностью. Откуда же берется для этого вторая копия ДНК? А она есть в составе каждой хромосомы, предположил А. Н. Лучник, опубликовав сначала теоретическую, а позднее ряд экспериментальных работ, подтверждающих это.

Научное сообщество не сразу восприняло утверждение, замахивающееся на взгляды целого поколения ученых, которое в 60-х годах ХХ века решило, что в каждой хромосоме содержится одна длинная молекула ДНК и информация о ней нигде не дублирована. (Гомологичные хромосомы не повторяют одна другую полностью, а соматическая конъюгация и рекомбинация, даже после облучения, — крайне редкие события). Надо сказать, что в 60-е годы в науке боролись две школы: одна отстаивала однонитчатую хромосому (где нить — это двойная спираль ДНК), а другая — многонитчатую. Постепенно стало ясно, что многонитчатые хромосомы встречаются у некоторых организмов или в некоторых тканях как исключение, а у большинства организмов и тканей хромосомы однонитчатые. На том этапе развития науки никто из сторонников однонитчатой модели не мог утверждать, что в хромосоме имеется только одна молекула ДНК, а не две, главное, стало ясно, что их не великое множество. С точки зрения этих исследователей, одна или две — было не важно. Решили, что, скорее всего, одна, иначе зачем клетке утруждать себя содержанием и обслуживанием второй копии? Это предположение осталось чисто умозрительным, потому что о проблеме надежности генома думал лишь небольшой круг генетиков, занимавшихся репарацией (ремонтом) ДНК. Однако, учитывая вышеизложенное, наличие второй копии, а значит, и репарация двойных разрывов ДНК на этой основе приобретают колоссальное биологическое значение.

Но иначе, как две копии в хромосоме человека, и быть не может, не то роду человеческому пришел бы конец. (Вторая копия повышает надежность генома примерно в 100 000—1 000 000 раз, а третья почти не повышает, поэтому-то их и две.) А. Н. Лучником была написана статью в «Journal of Theoretical Biology», в которой анализировались все опубликованные доводы в пользу однонитчатой модели и доказывалась их неубедительность. Тем более, что и сами авторы этих статей никогда не утверждали, что есть только одна копия, они лишь говорили, что не 20 и не 100. Вскоре открыли метод полимеразной цепной реакции, который позволял амплифицировать (многократно приумножить) ДНК одной-единственной клетки и получить ответ на вопрос о количестве копий ДНК в хромосоме. Только теперь, в XXI веке, появились работы других ученых, указывающие на двунитчатую (бинемную) структуру хромосом человека.

Но в чем все-таки причина генетической нестабильности раковых клеток? Если хромосома бинемна (то есть имеет две нити, вернее, две двойные спирали ДНК), то большая часть случайных разрывов ДНК залечивается полностью. Случайные разрывы ДНК у каждого человека возникают ежедневно (общая длина ДНК в одной клетке человека — около полутора метров). Если в хромосоме имеется однонитчатый (однодуплексный) участок, то разрывы дуплексов в этом месте не залечиваются, что ведет к разлому хромосомы и гибели дочерних клеток. От сюда вытекает общий принцип генетической нестабильности в злокачественных клетках: раковая клетка имеет наследуемые однонитчатые (однодуплексные) участки в одной или нескольких хромосомах или даже во всем геноме (последнее обнаружено при исследовании многих лейкозов). Теперь становится понятным, почему такая клетка с высокой вероятностью дает случайные разломы хромосом и гибель дочерних клеток. А что происходит в результате появления большого количества некротически гибнущих клеток, уже изложено в начале статьи.

Становится понятным также, почему рак лечат облучением, перегревом (гипертермией), избытком кислорода (гипероксигенацией) или некоторыми мутагенами. Все эти воздействия бьют по ДНК, а повреждения однонитчатых (однодуплексных) участков в отсутствие второй копии клетка отремонтировать не в состоянии; в результате раковые клетки, в отличие от нормальных, подвергаются массовой гибели. Все эти методы лечения не дают 100%-ной гарантии излечения многих видов рака.

Из статьи Т. Батенеевой «Ошибка опознания». (Известия. 14.06.2002.)

Наука больше столетия бьется над загадкой рака. Одна теория сменяла другую, некоторые гипотезы становились затем аксиомами, другие бесследно исчезали в научных архивах. Немногочисленные ученые, посягавшие на создание единой теории рака, чаще всего встречали резкую критику или, напротив, замалчивание. К концу ХХ века онкология пришла к выводу, что единой теории рака быть не может, поскольку нет одной, универсальной причины этой болезни.

И тем не менее доктор биологических наук Андрей Лучник, сотрудник Института биологии развития РАН, рискнул обнародовать гипотезу, предлагающую новый путь борьбы с самой страшной болезнью современности.

Все начинается с вопроса.

— Я считаю, что универсальный механизм возникновения рака удивительно прост, — говорит Андрей Лучник. — Эта мысль впервые пришла мне в голову лет 20 назад, но я не стал ее оформлять в виде статьи — казалось, это так очевидно, что наверняка кто-то уже написал или пишет подобную работу. Но годы шли, и я решил опубликовать статью в журнале «Онтогенез», издаваемом нашим институтом.

Отправной точкой для рассуждений Лучника послужило особое свойство раковых клеток — хромосомная нестабильность (хрупкость). Это явление изучал в 70-х отец Андрея Лучника — известный советский ученый Николай Лучник. В разговоре с ним и возникла впервые мысль о природе рака.

Кому — некроз, кому — апоптоз.

Если порезать палец, процесс заживления начинается немедленно. Первая его стадия — свертывание крови на поверхности раны. Клетки крови и мертвые клетки на поверхности раны принимают участие в процессе, выделяя специальные белки-цитокины, регулирующие процесс. Самые известные из цитокинов — факторы роста клеток. Это они вызывают рост все новых и новых клеток, которые заполняют рану. Для наглядности можно представить процесс так: погибая на поверхности раны, клетки, как доблестные воины, издают последний призывный клич — сообщают о своей гибели и зовут на подмогу. Откликаются все новые и новые шеренги бойцов — клетки, участвующие в ранозаживлении, со всех сторон спешат на помощь.

Некроз — не единственный способ смерти живых клеток. Чаще они погибают в процессе апоптоза — запрограммированной смерти, открытие которой было удостоено Нобелевской премии. Апоптоз сродни регулярному «техобслуживанию»: тестируя состояние своих органов и систем, организм своевременно заменяет выработавшие ресурс или поврежденные клетки, отдавая им приказ умереть.

Считается, что первый этап трансформации обычной клетки в злокачественную хорошо изучен: его запускают особые гены, которые так и называются — онкогены. Но затем трансформированные клетки начинают бесконтрольно делиться. При этом в каждом новом поколении обязательно возникают разломы хромосом, вызывающие их некротическую гибель.

Двойник ДНК спешит на помощь.

Факт частого возникновения разломов хромосом в раковых клетках известен. Но если обычная клетка (в которой хромосомы пострадали, к примеру, от облучения) умеет довольно быстро и успешно их ремонтировать, то раковая чаще всего ремонтирует лишь некоторую часть повреждений.

Андрей Лучник считает, что способность хромосомы к ремонту связана с наличием в ней не одной, а двух идентичных спиралей ДНК. Представления о том, что хромосома состоит не из одной, а из многих двойных спиралей (дуплексов) ДНК, высказывались еще на заре генетики, на эту тему много дискутировали в 60-х годах. Потом многонитчатое строение ДНК у некоторых клеток подтвердилось: в ядре некоторых бобовых, к примеру, — несколько одинаковых дуплексов, а у мухи-дрозофилы бывает по 1024 идентичных дуплекса. У остальных, решили ученые, в хромосоме содержится только одна молекула ДНК. Вопрос о том, что молекул может быть не одна, и не много, а две, не поднимался — тогда техника еще не позволяла выполнять столь тонкие эксперименты. Андрей Лучник утверждает, что и экспериментально подтвердил свое предположение. Зачем же человеку двойной запас прочности генетического материала?

— Копия ДНК повышает надежность генома в 100 тысяч и более раз. И прежде всего она необходима для ремонта разорванной молекулы, — уверен Лучник. — В этом случае необходимая информация просто копируется с одной спирали ДНК на другую, восстанавливая повреждения.

Это предположение ученый опубликовал в зарубежном научном «Журнале теоретической биологии» еще в 1982 году, а отчет о его экспериментальном подтверждении — в 1995-м. Есть и другие ученые, отстаивающие бинемную структуру хромосом человека, хотя эта теория до сих пор считается весьма спорной.

Незаживающая рана.

— Случайные разрывы ДНК возникают у каждого человека буквально каждый день, — продолжает Андрей Лучник. — Ведь общая длина молекулы ДНК в каждой клетке человека — почти полтора метра, а повреждающих факторов множество — от химических веществ до стрессов. Но в большинстве случаев ДНК сама себя прекрасно ремонтирует, так как рядом имеется вторая такая же. Если же в хромосоме есть однодуплексный участок, то разрыв в этом месте не ремонтируется. Клетка, имеющая в своих хромосомах несколько таких участков, становится злокачественной.

Согласно гипотезе Лучника, при делении таких клеток у них с высокой вероятностью ломаются хромосомы и они погибают от некроза. Если доля таких клеток достаточно велика (около 10%), организм воспринимает опухоль как рану, которую следует залечить, то есть стимулировать ее клетки к делению. Но если число «мертвых» клеток в настоящей ране становится все меньше с каждым циклом деления, то раковых в каждом поколении все больше и больше — опухоль растет неограниченно, со временем убивая весь организм.

Новые пути возможны.

Гипотеза Андрея Лучника открывает возможности поиска новых методов лечения. Если первопричиной опухоли служит дефект бинемной структуры хромосом, то клетки с такими повреждениями можно прицельно уничтожать. Для этого можно будет использовать, считает ученый, вещества, которые помогают найти скрытые повреждения и сделать их явными, — о них в 70-е годы писал Николай Лучник, назвав псевдомутагенами.

Гипотеза также дает единое объяснение, почему в ряде случаев успешна традиционная терапия — и облучение, и другие методы, и многие препараты, применяющиеся в онкологии, вызывают разрывы в однодуплексном участке хромосом раковых клеток и их массовую гибель. Конечно, любая теория только тогда может считаться подтвержденной, когда проверена практикой. Но борьба с раком — огромная задача, в которой любой новый подход заслуживает внимания.

Из статьи А. Лучника «Нуклеотидная последовательность человеческого генома должна быть укорочена примерно в два раза».

Публикация предварительных нуклеотидных последовательностей генома человека в Nature и Science, а также горячие летние дебаты о сильном несоответствии между двумя группами данных, заставила нас вспомнить важную информацию, полезную для понимания причин расхождений и обозначить верхний предел возможной длины нуклеотидной последовательности генома человека и гаплоидного содержания ДНК на клетку.

Дело в том, что обе группы исследователей старались достичь соответствия длины нуклеотидной последовательности гаплоидному содержанию ДНК на клетку человека. Последняя была грубо оценена в пределах 2,5–3,5 Gbp или 2,7–3,8 pg. Предпочтение было отдано цифре 3,26 Gbp или 3,5 pg ДНК на гаплоидный геном человека. Поэтому исследователи ожидали, что их результаты должны соответствовать упомянутой цифре.

Но длина генома и длина последовательностей его ДНК — это не одно и то же. Мы имеем в виду данные, указывающие на то, что один гаплоидный геном может содержать две идентичные копии ДНК. Бинемная структура увеличивает надежность генома против мутагенов окружающей среды или спонтанных повреждений по меньшей мере в 2 · 10⁵ раз. (Если мы допустим, что возникновение двух одновременных двунитевых разрывов ДНК, разделенных не более 20 bp в двух гомологичных нитях ДНК полностью могут быть репарированы и допустим здесь, что гаплоидная длина ДНК составляет примерно 3,200 Mbp.) Неотрепарированные двойные разрывы ДНК как правило ведут к хромосомным аберрациям и последующей некротической смерти клеток. Но иногда они приводят к делециям участков субхроматид или даже целых субхроматид, порождая, тем самым, однонитчатые участки в геноме. Это в свою очередь приводит к очень высокой хромосомной нестабильности, которая, в свою очередь, приводит к злокачественности клонов, содержащих унинемные участки ДНК в своих геномах.

Указания на бинемную структуру хромосом человека может независимым образом быть получено даже из опубликованных данных по сиквенированию генома человека. Ссылки на «несиквенируемый гетерохроматин» или на «все еще остающиеся пробелы» (достигающие ½ массы генома) являются спасительными перед лицом общепринятой массы гаплоидного генома (хотя последняя определена не так точно, как последовательность ДНК, но превышает ее примерно в 2 раза).

Наиболее надежные данные были получены с хромосомами 21 и 22, во-первых, потому, что они наиболее короткие, и, во-вторых, потому, что они были отсиквенированы тремя независимыми группами с очень хорошим совпадением результатов. Беря среднее значение, получим 33,5 Mbp для хромосомы 21 и 34,4 Mbp для хромосомы 22. Зная, что доля хромосомы 21 составляет 1,58% генома, мы получим оценку длины гаплоидного генома 2,12 Gbp (2,3 pg), что составляет только 66,2% от общепринятого значения для гаплоидного генома (3,2 Gbp). Но если мы примем верхнее значение для гаплоидного генома из статьи Мортона, мы получим цифру 60%. Аналогичным образом, если мы примем долю хромосомы 22 как 1,73% гаплоидного генома, то наша оценка величины гаплоидного генома станет 1,99 Gbp (2,16 pg), что составляет лишь 62,2% от принятой величины 3,2 Gbp или лишь 57%, если мы примем верхнюю оценку величины гаплоидного содержания ДНК (3,5 Gbp).

Таким образом, становится очень трудно ссылаться на «неклонирующийся гетерохроматин», составляющий почти половину массы ДНК хромосомы, или на «несиквенируемые пробелы», которые в этих хромосомах уже отсутствуют. Принимая во внимание сказанное выше, а также учитывая постоянно меняющиеся данные на NCBI-сайте в Интернете, мы оцениваем величину гаплоидного генома человека как 4200 Mbp, а длину последовательности его ДНК не более, чем в 2100 Mbp, но возможно и меньше, если мы допустим возможность дальнейшей вырожденности последовательности ДНК в некоторых хромосомах благодаря, например, существованию очень крупных тандемных повторов, приближающихся по длине к плечу хромосомы. Это никогда не сможет быть обнаружено на блотах по Сазерн, или выявлено существующими технологиями сиквенирования. Но эти повторы легко обнаруживаются с помощью in situ ДНК гибридизации.

Мы полагаем, что наши количественные оценки могут оказаться полезными в работе по сведению отсиквенированных участков в непрерывный ряд полинуклеотидных последовательностей, и в свою очередь смогут помочь получить окончательную последовательность ДНК генома человека.

Библиография

Лучник А. Н., Слезингер М. С., Ветрова Л. Н. Экспериментальные указания на бинемную структуру хромосом человека//Радиационная биология. Радиоэкология. 1996. Т.36. Вып.6.

Лучник А. Н. Общее звено в механизме самоподдержания злокачественного роста: Синдром незаживающей раны//Онтогенез. 2000. Т. 31 № 3.

Лучник А. Н. «Общий знаменатель» рака//Медицинская газета. 2002. № 26 (6254) от 3 апр.

Лучник А. Н. Формула рака//Наука и жизнь. 2002. № 5.

Luchnik A. N., Slesinger M., Vetrova L. N. Experimental evidence for the binemic structure of human chromosomes.Biochem//Mol. Biol. Int. 1995. V. 36. № 4.

doctor@mik.ru

Тема № 171

Эфир 19.11.2002

Хронометраж 47:40

www.ntv.ru

Сайт управляется системой uCoz